1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；AUW220D 型电子天平，日本岛津公司；DF-101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；DGJ-56T10NDP 型真空冷冻干燥机，北京赛欧华创科技有限公司；Ultima IV X 型射线粉末衍射仪，日本理学株式会社；DSC-4000 型差示扫描量热仪、Spectrum100 型傅里叶变换红外光谱仪，美国PerkinElmer 股份有限公司；ZRS-8G 型智能溶出试验仪，天津市天大天发科技有限公司。

1.2 材料

1.3 动物

2 方法和结果

2.1 黄芩苷含量测定[18]

2.1.1色谱条件采用HPLC 测定黄芩苷的含量。色谱柱为Phenomenex C18 键合硅胶柱（250 mm ×4.6 mm ，5 μm ）；流动相为甲醇-2% 冰醋酸水溶液（50 ∶50 ）；体积流量0.8 mL/min ；检测波长278 nm ；柱温25 ℃；进样量20 mL 。

2.1.2对照品溶液的制备精密称取10.00 mg 黄芩苷对照品于25 mL 量瓶中，加入适量甲醇超声溶解后定容，得400 mg/mL 对照品储备液。分别吸取不同体积的对照品储备液，用甲醇稀释成0.5 、1.0 、2.0 、4.0 、5.0 、10.0 、20.0 、40.0 、100.0 、200.0 mg/mL 的黄芩苷对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备取黄芩苷/ 多糖（葡聚糖、菊糖、普鲁兰多糖、黄原胶、透明质酸）复合物5.00 mg ，置于5 mL 量瓶中，加入甲醇溶解药物，定容，摇匀，15 000 r/min 离心（离心半径8.2 cm ）10 min 去除多糖，取上清液得供试品溶液。

2.1.4专属性考察称取适量黄芩苷对照品，加入甲醇超声溶解得黄芩苷对照液；分别称取适量葡聚糖、菊糖、普鲁兰多糖、黄原胶、透明质酸溶于水中得不同多糖溶液；分别取黄芩苷/ 多糖（葡聚糖、菊糖、普鲁兰多糖、黄原胶、透明质酸）供试品溶液；进样测定，黄芩苷、各多糖和黄芩苷/ 多糖复合物的HPLC 图见图1 ，黄芩苷出峰时间为12.8 min ，峰形良好，多糖对药物含量测定无干扰，黄芩苷含量测定方法专属性良好。

2.1.5线性关系考察取各质量浓度对照品溶液进 样测定，记录峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），对照品溶液质量浓度为横坐标（X ）进行线性回归，得回归方程为Y ＝68.389 X －11.044 ，R 2＝0.999 9 ，结果表明黄芩苷在0.5 ～200.0 mg/mL 线性关系良好。

2.1.6检测限和定量限以黄芩苷峰面积与仪器噪音峰面积的比值等于3 作为检测限，结果黄芩苷的检测限为0.1 mg/mL ；以黄芩苷峰面积与仪器噪音峰面积的比值等于10 作为定量限，结果黄芩苷的定量限为0.2 mg/mL 。

2.1.7精密度试验分别吸取不同体积的对照品储备液，用甲醇稀释成0.5 、10.0 、200.0 mg/mL 的对照品溶液，1 d 内连续测定3 次，连续测定3 d ，计算日内精密度和日间精密度，结果日内精密度RSD 分别为0.57% 、0.55% 、0.16% ，日间精密度RSD 分别为1.77% 、1.09% 、0.82% ，满足方法学要求。

2.1.8稳定性试验分别取黄芩苷/ 多糖（葡聚糖、 菊糖、普鲁兰多糖、黄原胶、透明质酸）供试品溶液，于 0 、2 、4 、8 、12 、24 h 进样测定，记录峰面积。结果得黄芩苷/ 多糖（葡聚糖、菊糖、普鲁兰多糖、黄原胶、透明质酸）中黄芩苷峰面积的RSD 分别为1.79%、1.18%、1.68%、1.64%、0.93%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好，满足方法学要求。

2.1.9重复性试验分别取黄芩苷/ 多糖（葡聚糖、菊糖、普鲁兰多糖、黄原胶、透明质酸）供试品溶液6 份，进样测定，记录峰面积。结果得黄芩苷/ 多糖（葡聚糖、菊糖、普鲁兰多糖、黄原胶、透明质酸）中黄芩苷质量分数的RSD 分别为1.15% 、0.86% 、1.14% 、0.96% 和1.10% ，表明该方法重复性良好。

2.1.10加样回收率试验分别取1 、20.0 、400.0 mg/mL 的黄芩苷对照品溶液500 mL ，加入2 mg/mL 的葡聚糖、菊糖、普鲁兰多糖、黄原胶、透明质酸溶液至1 mL ，配制成质量浓度为0.5 、10.0 、200.0 μg/mL 的样品溶液，每个质量浓度平行3 份，进样测定，记录峰面积，计算平均加样回收率，结果见表1 ，满足方法学要求。

2.2 Bai/HA Co载体多糖的筛选

2.2.1 黄芩苷与多糖相互作用的分子模拟

（2）分子动力学模拟：分别将上述能量最低的对接结果导出，使用OpenBabel 软件改为mol2 格式文件，使用Sobtop [21]程序处理mol2 文件并计算MMFF94 分子电荷，导出为Gromacs [22]软件可用的文件格式。采用Gromacs 软件，使用用于液体模拟的全原子优化势能（optimized potentials for liquid simulations all-atom ，OPLS-AA ）力场，进行分子动力学模拟，首先将体系置于spc216 水模型的立方体水盒中，盒子边界距体系1.0 nm ，添加0.1 mol/L 的NaCl平衡离子，接着进行体系能量最小化过程，在NVT系综下运行0.25 ns以达到设定温度和松弛体系，之后采用NPT系综、温度为298 K、压力为100.0 kPa，温度控制采用V-rescale方法，压力控制采用Parrinello-Rahman方法，步长为2 fs，运行20 ns的分子动力学模拟。最后使用gmx_MMPBSA软件对模拟结果进行分析，分别计算黄芩苷与不同多糖之间的结合自由能。均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）分析结果见图3，黄芩苷均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF）结果见图4，分子动力学模拟结合自由能结果见表2。

2.2.2不同多糖对黄芩苷的增溶作用分别取2 mg/mL 的多糖（葡聚糖、菊糖、普鲁兰多糖、黄原胶、透明质酸）水溶液4 mL ，加入2 mg 黄芩苷，在75 ℃的水浴中加热30 min ，取出后涡旋30 s ，冷却至室温，4 000 r/min 离心（离心半径8.2 cm ）10 min ，去除未溶解药物，将上清液过0.45 μm 微孔滤膜。取200 μL 滤液加入800 μL 甲醇，涡旋30 s ，放置10 min ，15 000 r/min 离心（离心半径8.2 cm ）10 min ，取上清液以HPLC 法测定黄芩苷质量浓度，同法测定黄芩苷在蒸馏水中的质量浓度作为对照，计算增溶倍数，结果见表2 。

如图2 所示，黄芩苷与葡聚糖、菊糖、普鲁兰多糖、黄原胶4 种多糖分子之间的氢键个数在0 ～1 ，与透明质酸分子之间能够形成2 个氢键，分别位于其羟基和酮羰基上，氢键的相互作用较为稳定，同时，位于黄芩苷分子两端的氢键也能够更有效地固定住黄芩苷和透明质酸，结合增溶能力的不同，因此，黄芩苷与透明质酸之间的结合能大于其他4 个多糖分子。

RMSD 常用来表明该模拟是否达到平衡，从图3 可见，黄芩苷与5 种多糖的RMSD 值一直在一个较小的范围内波动，在模拟结束时也达到了一个较为稳定的状态，说明模拟时间已经足够长。黄芩苷与透明质酸的RMSD 波动幅度明显小于其他4 种多糖，黄芩苷与透明质酸在分子动力学模拟过程中的位置相对于最初的复合物结构并未发生较大改变，说明黄芩苷与透明质酸的体系更加稳定。黄芩苷的RMSF图（图4）可显示黄芩苷各个原子的位置变化情况，5种多糖中，第13～28个原子的波动均比较小，波动较大的原子集中在第5～12个和第32～40个，这些原子多数为氢氧原子，作为氢键的供体和受体，更加容易与多糖分子形成氢键，当黄芩苷与透明质酸相互作用时，其对应原子的RMSF值显著降低，说明黄芩苷与透明质酸之间形成的氢键更加稳定，结合RMSD值，可以推出黄芩苷与透明质酸之间更容易形成稳定的复合物。

分子模拟计算的结合能结果和增溶实验的结果基本一致，虽然同种多糖在不同相对分子质量下对药物的增溶能力可能会有一定程度的差异，但所选多糖均为结构单元明确的均一多糖，通过对多糖结构单元进行拟合的结果能够一定程度上反映出不同多糖的增溶效果差异。结果表明，随着对接和结合自由能（ΔG 对接和ΔG 结合）绝对值的增加，多糖对黄芩苷的增溶效果越好。通过上述RMSD、RMSF的分析和ΔG 的计算，结合增溶实验的结果可知，透明质酸对黄芩苷的结合能力和增溶能力均好于其他4种多糖，因此，选择透明质酸为黄芩苷/多糖复合物载体。

2.3 Bai/HA Co的制备及处方工艺优化

2.3.1 Bai/HA Co 制备取适量透明质酸溶于蒸馏水，配成一定质量浓度的透明质酸溶液。取该溶液4 mL ，加入2 mg 黄芩苷，在一定温度水浴中以一定速度搅拌一定时间，取出后冷却至室温，4 000 r/min 离心（离心半径8.2 cm ）10 min 去除未溶解药物，上清液过0.45 μm 微孔滤膜，取滤液冷冻干燥，即得Bai/HA Co 。

2.3.2 Bai/HA Co 的载药量测定精密称取5 mg Bai/HA Co ，置于5 mL 量瓶中，加入甲醇溶解药物，定容，摇匀，15 000 r/min 离心（离心半径8.2 cm ）10 min 去除透明质酸，取上清液适当稀释后，以HPLC 法测定黄芩苷质量浓度，按下式计算载药量。

载药量＝复合物中药物的质量/ 复合物的总质量

2.3.3 单因素实验考察Bai/HA Co 处方工艺以增溶倍数和载药量为指标，分别考察透明质酸质量浓度（0.8 ～5.0 mg/mL ，A ）、加热温度（40 ～80 ℃，B ）、搅拌速度（650 ～1 050 r/min ，C ）和搅拌时间（0.5 ～2.5 h ，D ）对Bai/HA Co 处方工艺的影响，结果见表3 ～6 。透明质酸质量浓度、加热温度对增溶倍数和载药量均有明显影响。随着透明质酸质量浓度增大，增溶倍数增大，但载药量却减低。随着加热温度升高，增溶倍数和载药量均呈现先增大后减小的现象。而搅拌速度和搅拌时间对增溶倍数和载药量的影响不如透明质酸质量浓度和加热温度明显。随着搅拌速度、搅拌时间增加，增溶倍数和载药量均呈现先逐渐增大后减小的现象。搅拌时间为1 h时，增溶倍数达到最大值17.51倍，载药量也最大，为23.88%。考虑到搅拌时间对增溶倍数和载药量没有明显影响，且搅拌时间过长会影响复合物的结构稳定性，因此后续实验中搅拌时间固定为1 h。

2.3.4 Box-Behnken 设计- 响应面法（Box-Behnken design-response surface methodology ，BBD-RSM ）考察Bai/HA Co 处方工艺采用BBD-RSM （Design-Expert 13 软件）对Bai/HA Co 的处方工艺进行优化。以透明质酸质量浓度（X1 ）、加热温度（X2 ）、搅拌速度（X3 ）为自变量，增溶倍数和载药量为响应值，3 个变量的因素水平、BBD-RSM 实验设计及结果见表7 。

通过方差分析，对实验数据进行多元二次回归模型拟合，拟合结果见表8 。增溶倍数为响应值时模型的P 值为0.000 2 ，载药量为响应值时模型的P 值小于0.000 1 ，其中X1 的P 值在2 个表中均小于0.000 1 ，说明透明质酸浓度对增溶倍数和载药量的影响最显著。其中拟合缺失的P 值分别为0.201 2 和0.060 9 ，因此模型得到的数据与实验数据拟合良好。两者的拟合方程分别为增溶倍数＝26.950 ＋6.330 X1 －0.276 2 X2 ＋0.338 7 X3 ＋0.987 5 X1X2 －0.247 5 X1X3 ＋2.540 X2X3 －2.060 X12 －1.940 X22 －1.980 X32 ，R 2＝0.97 ，R adj2＝0.93 ，变异系数（CV ）＝5.70% ；载药量＝−12.520 X1 ＋0.906 9 X2 ＋0.271 2 X3 －1.640 X1X2 －0.222 5 X1X3 ＋0.875 X2X3 ＋8.710 X12 －1.080 X22 －0.563 4 X32 ，R 2＝0.99 ，R adj2＝0.98 ，CV ＝9.89% 。

依据拟合的数学模型，分别绘制两两因素对评价指标的三维效应面图（图5 ）。根据最终预测结果，并结合实际情况，确定处方工艺：透明质酸质量浓度2 mg/mL 、加热温度65 ℃、搅拌速度900 r/min 。

2.3.5 优化处方工艺验证根据优化的处方工艺制备3 批Bai/HA Co ，对优化处方工艺进行验证。优化后处方工艺预测的增溶倍数为24.48 倍、载药量为17.71% 。3 批样品测得的增溶倍数为23.37 倍、载药量为17.09% ，与模型预测的相对误差分别为4.52% 和3.50% ，说明通过响应面法进行的处方工艺优化和预测的处方工艺参数是准确可靠的。因此，最终确定制备Bai/HA Co 的处方工艺为透明质酸质量浓度2 mg/mL 、水浴加热温度65 ℃、搅拌速度900 r/min 、搅拌时间1 h 。

2.4 Bai/HA Co的体外溶出研究

2.4.1 不同溶出介质中黄芩苷质量浓度测定方法

（1）色谱条件：按“2.1.1 ”项下色谱条件，测定体外溶出样品中黄芩苷质量浓度。

（2 ）对照品溶液的制备：分别精密称取2.00 mg 黄芩苷对照品于50 mL 量瓶中，加入少量乙醇溶解后分别以去离子水、pH 1.2 盐酸溶液、pH 4.5 醋酸盐缓冲液和pH 6.8 磷酸盐缓冲液（PBS ）定容，得40 mg/mL 黄芩苷对照品储备液。吸取不同体积的对照品储备液，分别用去离子水、pH 1.2 盐酸溶液、pH 4.5 醋酸盐缓冲液和pH 6.8 PBS 稀释成0.5 、1.0 、2.0 、5.0 、10.0 、20.0 mg/mL 的不同溶出介质的黄芩苷对照品溶液。

（3 ）供试品溶液的制备：取黄芩苷/ 透明质酸复合物5.00 mg ，置于50 mL 量瓶中，分别用去离子水、pH 1.2 盐酸溶液、pH 4.5 醋酸盐缓冲液和pH 6.8 PBS 溶解药物，定容得供试品溶液。

（4）专属性考察：分别称取适量黄芩苷对照品，加入少量乙醇溶解后以去离子水、pH 1.2 盐酸溶液、pH 4.5 醋酸盐缓冲液和pH 6.8 PBS 稀释，制备不同溶出介质的黄芩苷对照液；称取适量透明质酸，分别溶于去离子水、pH 1.2 盐酸溶液、pH 4.5 醋酸盐缓冲液和pH 6.8 PBS 中得不同溶出介质的透明质酸溶液；称取适量Bai/HA Co ，分别用去离子水、pH 1.2 盐酸溶液、pH 4.5 醋酸盐缓冲液和pH 6.8 PBS 溶解，得复合物样品液；进样测定，记录色谱图。不同溶出介质中各样品的HPLC 图见图6 。去离子水、pH 1.2 盐酸液、pH 6.8 PBS 中黄芩苷出峰时间均为12.8 min ，pH 4.5 醋酸盐缓冲液中黄芩苷出峰时间为13.3 min ，峰形均良好，透明质酸对黄芩苷测定无干扰，方法专属性良好。

（5）线性关系考察：分别取不同介质的不同质量浓度对照品溶液进样测定，记录峰面积，以峰面积为纵坐标（Y ），对照品溶液质量浓度为横坐标（X ） 绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程：去离子水中的标准曲线方程为 Y ＝90.043 X －39.941 ，R 2＝0.999 7 ，pH 1.2 盐酸液中的标准曲线方程为Y ＝61.516 X －20.23 ，R 2＝0.999 1 ，pH 4.5 醋酸盐缓冲液中的标准曲线方程为Y ＝77.872 X ＋8.355 4 ，R 2＝0.999 4 ，pH 6.8 PBS 中的标准曲线方程为Y ＝80.174 X －33.964 ，R 2＝0.999 0 ，结果表明黄芩苷在0.5 ～20.0 mg/mL 线性关系均良好。

（6）检测限和定量限：以黄芩苷峰面积与仪器噪音峰面积的比值等于3 作为检测限，结果在不同溶出介质中黄芩苷的检测限均为0.1 mg/mL ；以黄芩苷峰面积与仪器噪音峰面积的比值等于10 作为定量限，结果在不同溶出介质中黄芩苷的定量限均为0.2 mg/mL 。

（7 ）精密度试验：分别吸取各溶出介质的黄芩 苷对照品储备液，用对应的溶出介质稀释成0.5、5.0、20.0 mg/mL 的黄芩苷对照品溶液，1 d 内连续测定3 次，连续测定3 d ，计算日内精密度和日间精密度。结果去离子水中，低、中、高质量浓度黄芩苷对照品溶液的日内精密度RSD分别为0.26%、0.27%、0.05%，日间精密度RSD分别为0.86%、0.43%、1.65%；pH 1.2盐酸液中，低、中、高质量浓度黄芩苷对照品溶液的日内精密度RSD分别为0.92%、0.31%、0.55%，日间精密度RSD分别为1.08%、0.66%、0.43%；pH 4.5醋酸盐缓冲液中，低、中、高质量浓度黄芩苷对照品溶液的日内精密度RSD分别为0.96%、0.66%、0.44%，日间精密度RSD分别为1.64%、0.83%、0.41%；pH 6.8 PBS中，低、中、高质量浓度黄芩苷对照品溶液的日内精密度RSD分别为1.38%、0.34%、0.34%，日间精密度RSD分别为0.52%、0.33%、0.89%，均满足方法学要求。

（8 ）稳定性试验：分别取黄芩苷/ 透明质酸供试品溶液，于0 、2 、4 、8 、12 、24 h 进样测定，记录峰面积。结果得去离子水、pH 1.2 盐酸液、pH 4.5 醋酸盐缓冲液和pH 6.8 PBS 中黄芩苷/ 透明质酸的黄芩苷峰面积RSD 分别为1.53% 、1.36% 、1.33% 和1.70% ，均满足方法学要求。

（9）加样回收率试验：分别取1.0 、10.0 、40.0 mg/mL 质量浓度的各溶出介质黄芩苷对照品溶液500 mL ，加入2 mg/mL 的透明质酸溶液至1 mL ，配制成质量浓度为0.5 、5.0 、20.0 μg/mL 的样品溶液， 每个质量浓度平行3份，进样测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果去离子水中，低、中、高质量浓度样品溶液的平均加样回收率分别为101.45% 、100.49% 、100.20% ，RSD 分别为1.26% 、1.16% 、0.23% ；pH 1.2 盐酸液中，低、中、高质量浓度样品溶液的平均加样回收率分别为100.02% 、100.19% 、100.59% ，RSD 分别为0.93% 、0.23% 、0.95% ；pH 4.5 醋酸盐缓冲液中，低、中、高质量浓度样品溶液的平均加样回收率分别为100.88% 、100.27% 、99.72% ，RSD 分别为1.61% 、0.58% 、0.63% ；pH 6.8 PBS 中，低、中、高质量浓度样品溶液的平均加样回收率分别为99.69% 、99.18% 、99.05% ，RSD 分别为1.14% 、0.84% 、0.47% ，均满足方法学要求。

2.4.2 体外溶出考察参照《中国药典》2020 年版第四部溶出度与释放度测定法第二法（浆法）进行测定。溶出介质分别为900 mL 去离子水、pH 1.2 盐酸溶液、pH 4.5 醋酸盐缓冲液和pH 6.8 缓冲液，转速为50 r/min 。精密称取黄芩苷、BA/HA PM 、Bai/HA Co 适量（均相当于6.0 mg 黄芩苷），进行实验，于5 、10 、20 、30 、45 和60 min 取样10 mL ，同时补加同体积同温度的新鲜溶出介质。取出的样品经0.45 mm 微孔滤膜过滤后，用HPLC 法测定，计算黄芩苷的累积溶出率并绘制溶出曲线。各样品的体 外溶出曲线如图7所示。在水中，5 min时，复合物、物理混合物、黄芩苷原料药的溶出分别为99.0% 、61.7%、36.7%，复合物的溶出明显快于黄芩苷原料药和物理混合物，而物理混合物又快于原料药；60 min时，物理混合物溶出率（85.8%）大于黄芩苷（74.3%）。在胃肠道不同的pH环境下，黄芩苷分子以不同形式存在，吸收存在差异，因此在不同pH的溶出介质中考察黄芩苷的溶出有助于分析其在胃肠道不同阶段的溶出和吸收。由图7可知，随着pH升高，复合物、物理混合物、黄芩苷原料药的溶出均增加，且在pH 1.2和4.5介质中，复合物的溶出明显快于物理混合物和黄芩苷原料药，pH 6.8介质中，三者溶出无明显差异，复合物中的黄芩苷也能快速溶出。可见形成复合物后，能够明显改善黄芩苷在pH 1.2和4.5条件下的溶出速度，增加药物溶出。

2.5 Bai/HA Co的增溶机制探讨

2.5.1 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy ，FT-IR ）分析取透明质酸、黄芩苷、黄芩苷/ 透明质酸物理混合物（baicalin/ hyaluronic acid physical mixture，Bai/HA PM）、Bai/HACo 适量，分别与溴化钾粉末研匀并压片，在4 000 ～500 cm −1记录红外吸收光谱并进行分析，结果见图8 。透明质酸的特征峰主要在3 275 cm −1左右羧基的-OH 伸缩振动吸收峰和1 604 cm −1处酰胺的羰基吸收峰。黄芩苷的特征峰为3 547 cm −1的游离羟基峰，3 488 、3 391 cm −1的分子间羟基结合峰。Bai/HA PM 在3 546 、3 486 、3 393 cm −1处出现了黄芩苷的特征吸收峰，在3 277 、1 604 cm −1处出现了透明质酸的特征吸收峰，表明Bai/HA PM 中二者没有发生相互 作用。而在Bai/HA Co的图谱中，3 546、3 486、3 393cm −1处的黄芩苷特征峰消失了，3 275 cm −1处透明质酸-OH 的伸缩振动峰，红移至3 263 cm −1处，表明黄芩苷和透明质酸的羟基之间产生了相互作用，可能生成了氢键。

2.5.2 差示扫描量热（differential scanning calorimeter ，DSC ）分析取黄芩苷、透明质酸、Bai/ HA PM 、Bai/HA Co 约5 mg ，分别置于非密封压接的铝锅中，于干燥氮气下在30 ～300 ℃加热，线性加热速率为10 ℃/min ，氮气体积流量为20 mL/min ，结果见图9 。黄芩苷原料药在220.15 ℃处有一明显的熔点峰，Bai/HA PM 在220.63 ℃左右出现了黄芩苷的熔化吸热峰，稍高于黄芩苷熔点峰，这可能是由于在升温过程中，黄芩苷和透明质酸在高温下发生了一定的相互作用。而Bai/HA Co 的黄芩苷熔点峰消失，说明药物以无定型状态存在。

2.5.3 粉末X射线衍射（powder X-ray diffraction，PXRD）分析取黄芩苷、透明质酸、Bai/HA PM、Bai/HA Co适量，分别在40 kV的电压和25 mA的电流下测定，以2°/min的扫描速率在5°＜2θ ＜90°10。黄芩苷原料药有明显的结晶特征峰，与文献报道一致[23]；Bai/HA PM也出现了明显的黄芩苷结晶的特征峰，说明简单的物理混合对药物晶型没有影响；但Bai/HA Co未观察到黄芩苷结晶特征峰，说明药物在复合物中以非晶态形式存在。

2.5.4 Bai/HA 分子动力学模拟

（1）分子结构文件建立：采用GLYCAM 力场（http://legacy.glycam.org ）工具构建透明质酸二糖单元，对重复单元进行复制构建透明质酸分子链。透明质酸和黄芩苷分子拓扑参数由Ambertools21 [24]软件包进行确定，透明质酸分子采用GLYCAM 06j [25]力场，药物小分子采用GAFF 力场[26]，使用acpypes 转换为GROMACS 格式，分子动力学模拟均使用GROMACS 2021.5 软件包进行计算，结构图形观察使用VMD 1.9.3 [27]软件。

（2）分子动力学（molecular dynamics ，MD ）模拟：使用Packmol 软件将10 个透明质酸分子链平行排布在10 nm ×10 nm ×10 nm 的盒子中，并在其中填充20 个黄芩苷药物分子，将体系置于spc216 水模型的立方体水盒中，盒子边界距体系1.0 nm ，添加0.1 mol/L 的Na 、Cl 平衡离子，接着进行体系能量最小化过程，在NVT 系综下运行0.25 ns 以达到设定温度和松弛体系，之后采用NPT 系综、温度为298 K 、压力为100.0 kPa ，温度控制采用V-rescale 方法，压力控制采用Parrinello-Rahman 方法，步长为2 fs ，运行1 000 ns 的分子动力学模拟。提取轨迹文件，使用Gromacs 分别计算Bai/HA Co 体系的均方根偏差（root mean square deviation ，RMSD ）、溶剂可及表面积（solvent-accessibility surface area ，SASA ）和黄芩苷与透明质酸之间氢键数量。最初和最终构象结果如图11 所示，模拟分析结果如图12 所示。由图11 可见，在MD 最初时透明质酸和黄芩苷均相互分开，没有相互接触，在经过1 000 ns 的MD模拟后，透明质酸分子相互缠绕，黄芩苷分子分散在透明质酸分子之间，说明黄芩苷以非晶形态存在，这与PXRD和DSC结果相符。从图12-A中可以看出，在MD模拟过程中，体系的RMSD始终保持在6 nm左右波动，但波动范围较大，有多个平台期，这可能是由于透明质酸是一种相对分子质量较大的长链柔性分子，在水溶液中具有较强的柔性所导致[28-29]，由轨迹中可以看出，未与黄芩苷结合或者与自身缠绕的透明质酸链端会在水溶液中不断摆动，或者因此整个体系的RMSD值都会持续波动；由图12-B可见，黄芩苷和透明质酸相互作用的氢键数量在模拟初期快速增加，最终稳定在平均每个黄芩苷与透明质酸形成2.5个氢键，这与分子对接结果类似；溶剂可及表面积（solvent-accessibility surface area，SASA）值是一种可以较好地反映药物 分子暴露在溶剂中面积的指标，由黄芩苷和黄芩苷/透明质酸体系的SASA分析结果图12-C和12-D可见，黄芩苷/透明质酸体系在前600 ns内SASA值不断下降，说明体系之间相互接触，使能够与水接触的面积减少，在通过药物与药物、药物与透明质酸、透明质酸与透明质酸之间相互结合和缠绕过程后，600 ns后体系的SASA值逐渐趋于稳定，同时正是由于药物分子在前600 ns与透明质酸分子相结合，药物分子的SASA值（图12-C）也同时在600 ns后能够保持稳定，说明此时体系中的黄芩苷已与透明质酸达到较为稳定的结合状态，黄芩苷能够较好地埋藏在透明质酸结合位点中。因此，由以上MD模拟结果可见，该体系在相互作用后在水中可能是一个以药物分子使透明质酸相连的体系，摆动的透明质酸分子链又进一步地捕捉更多的药物和透明质酸，形成了更大的Bai/HA Co体系。这也解释了为什么多糖分子对黄芩苷结合能越大其对黄芩苷的增溶效果越强，更大的结合能数值使得反应越容易进行，黄芩苷/多糖复合物越容易形成，体系能够更加稳定。

2.6 Bai/HA Co的体内药物动力学

2.6.1 黄芩苷的体内分析方法参考文献方法[18]，采用HPLC 测定黄芩苷的含量。

（1）色谱条件：色谱柱为Phenomenex C18 键合 硅胶柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-2% 冰醋酸水溶液（54 ∶46 ）；体积流量0.8 mL/min ；检测波长278 nm ；柱温25 ℃；进样量20 mL 。

（2）黄芩苷对照品母液的制备：精密称取黄芩苷对照品2.50 mg ，置于25 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，得100 μg/mL 黄芩苷对照品母液。

（3）内标溶液（对羟基苯甲酸甲酯溶液）的制备：精密称取对羟基苯甲酸甲酯5.00 mg ，置于25 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，得200 μg/mL 内标母液，精密吸取1 mL 母液于10 mL 量瓶中，加甲醇定容，得20 μg/mL 内标溶液。

（4）黄芩苷对照品溶液：精密吸取一定量黄芩苷对照品母液，适当稀释后配制1 、4 、8 、12 、16 、20 μg/mL 的黄芩苷对照品溶液。分别取该系列质量浓度黄芩苷对照品溶液50 μL ，加入大鼠空白血浆至100 μL ，配制成0.5 、2.0 、4.0 、6.0 、8.0 、10.0 μg/mL 的血浆黄芩苷对照品溶液。

（5）血浆样品处理：取100 μL 血浆样品于1.5 mL 离心管中，加入30 μL 1 mol/L 磷酸二氢钠将血浆预酸化，涡旋2 min ，再加入20 μL 内标溶液，涡旋2 min ，加入250 μL 甲醇，涡旋5 min ，在15 000 r/min 、4 ℃条件下离心（离心半径8.2 cm ）15 min 。取上清100 μL ，得血浆样品，按“2.6.1 （1 ）”项下色谱条件进样测定。

（6）专属性考察：按照“2.6.1 （5 ）”项下的样品处理方法，制备空白血浆、空白血浆＋内标＋黄芩苷对照品的样品液，另取给药后血浆样品，进样测定，考察该方法专属性。血浆样品黄芩苷的HPLC 图如图13 所示，黄芩苷出峰时间为9.8 min ，内标（对羟基苯甲酸甲酯）出峰时间为8.4 min ，内标和黄芩苷分离度为2.47 ，内标以及血浆内源性物质对黄芩苷测定无干扰，专属性良好。

（7）线性关系考察：取不同质量浓度的血浆黄芩苷对照品溶液，按照“2.6.1 （5 ）”项下方法处理后，进样测定，以黄芩苷峰面积与内标峰面积之比（A B/A i）为纵坐标，黄芩苷质量浓度（C B）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为A B/A i＝0.434 4 C B－0.112 9 ，R 2＝0.999 6 （n＝3 ），结果表明黄芩苷在0.5 ～10.0 mg/mL 线性关系良好。

（8）检测限和定量限考察：以黄芩苷峰面积与仪器噪音峰面积的比值等于3作为检测限，结果为0.2 mg/mL；以黄芩苷峰面积与仪器噪音峰面积的比值等于10作为定量限，结果为0.5 mg/mL。

（9）精密度试验：分别制备黄芩苷质量浓度为0.5 、4.0 、10.0 μg/mL 的血浆样品，每个质量浓度平行5 份，按照“2.6.1 （5 ）”项下方法处理后，进样测定，1 d 内平行测定5 次，连续测定3 d 。日内精密度RSD 分别为2.38% 、0.41% 、0.14% ，日间精密度RSD 分别为1.84% 、1.87% 、1.22% ，均满足方法学要求。

（10）稳定性试验：取血浆样品按照“2.6.1 （5 ）”项下的方法处理后，分别于0、2 、4 、8 、12 、24 h 进样测定，结果黄芩苷和内标峰面积比值的RSD 为1.60% ，表明血浆样品溶液稳定性良好，满足方法学要求。

（11 ）重复性试验：取血浆样品溶液6 份，按照“2.6.1 （5 ）”项下方法处理后，进样测定。结果黄芩苷和内标峰面积比值的RSD 为1.32% ，表明该方法重复性良好。

（12）萃取回收率考察：分别制备黄芩苷质量浓度为0.5 、4.0 、10.0 μg/mL 的血浆样品溶液，每个质量浓度平行5 份，按“2.6.1 （5 ）”项下方法处理后，进样测定，计算黄芩苷和内标峰面积的比值（E ）；另取相应质量浓度的黄芩苷和内标溶液，进样测定，得黄芩苷和内标峰面积比值（F ），按公式萃取回收率＝E/F 计算萃取回收率。测得平均萃取回收率分别为96.90% 、97.60% 、99.91% ，RSD 分别为4.08% 、4.54% 、2.82% ，均满足方法学要求。

2.6.2 药物动力学实验取12 只SD 大鼠随机分为黄芩苷原料药组和Bai/HA Co 组。于实验前14 h 禁食不禁水。黄芩苷原料药组用0.5% CMC-Na 水溶液配制黄芩苷质量浓度为10 mg/mL 的混悬液，Bai/HA Co 组用蒸馏水配制成相当于黄芩苷质量浓度为10 mg/mL 的溶液，按100 mg/kg 的剂量ig 给药，ig 后于5 、10 、20 、30 min 和1 、2 、4 、6 、8 、9 、10 、12 、14 、24 h 眼眶取血0.3 mL ，4 000 r/min 离心（离心半径8.2 cm ）10 min ，收集血浆，血浆样品经处理后用HPLC 法测定黄芩苷质量浓度。大鼠给药后，黄芩苷和Bai/HA Co 的血药浓度- 时间曲线如图14 所示。采用DAS 2.0 软件计算药动学参数，结果见表9 。从图14 可以看出，Bai/HA Co 的血药浓度曲线并未出现规则的单一吸收峰，Bai/HA Co组分别在4 h和9 h处出现了血药浓度的较高点，且Bai/HA Co的血药浓度明显高于黄芩苷原料药，可见黄芩苷与透明质酸形成复合物后吸收增加。由表9可知，Bai/HA Co的AUC0～t、AUC0～∞、T max和C max均明显大于黄芩苷原料药（P ＜0.001），AUC0～∞和C max分别是黄芩苷原料药的2.24倍和2.59倍，生物利用度显著提高（F r＝224.22%）。

3 讨论

不同多糖对黄芩苷的增溶效果存在差异，分子动力学模拟结果显示随着多糖分子和黄芩苷分子之间对接和结合自由能（ΔG 对接和ΔG 结合）绝对值的增加，多糖对黄芩苷的增溶效果越好，这可能是由于黄芩苷与多糖的结合作用是自发进行的，该过程越容易进行，其结合能力越强，形成的复合物越稳定，因此增溶效果越好，其中透明质酸对黄芩苷的增溶效果最好。

在Bai/HA Co 制备工艺优化的单因素实验中，随着透明质酸浓度增大，增溶倍数增大，但载药量却减低。这可能是因为随着透明质酸浓度不断提高，为黄芩苷提供更多的载药位点，使增溶倍数增大；但由于透明质酸的高相对分子质量，更多透明质酸分子的存在，使其在处方中的质量明显增加，载药量降低。温度的影响可能是因为当温度较低时，随着温度的升高，黄芩苷更容易进入透明质酸链组成的结构中，但当温度过高时，形成的复合物结构不稳定。在复合物的制备中搅拌主要起促进黄芩苷进入透明质酸分子链中的作用，低速搅拌能够加快透明质酸和黄芩苷相互接触，而当搅拌速度过高时，体系始终处于不稳定状态，透明质酸结构更易被破坏，处于其中的黄芩苷分子也更难稳定结合。黄芩苷分子与透明质酸分子接触并发生相互作用形成复合物需要一定的时间才能完成，从而表现出在初期随着搅拌时间增加，溶解度增大，增溶倍数提高，载药量增大，在1 h 时体系已经达到了一个相对稳定的状态，当进一步增加搅拌时间，可能对透明质酸的空间结构或复合物的结构稳定性产生影响，使溶解度减小，增溶倍数降低，载药量减小。

通过FT-IR 、DSC 和PXRD 分析结果表明，药物在Bai/HA Co 中以无定型状态存在。同时，黄芩苷/ 透明质酸的分子模拟结果显示黄芩苷分子分散在透明质酸的分子链中，二者相互作用的结合能绝对值较大，使得反应容易进行，Bai/HA Co 容易形成，体系较稳定，使透明质酸对黄芩苷的增溶效果较好。因此，在体外溶出实验中，Bai/HA Co 能够加快黄芩苷的溶出速度，这是因为当药物高度分散在亲水性的透明质酸中，能够使药物快速溶出；物理混合物中，药物以结晶形式分散在透明质酸中，透明质酸的亲水性有助于药物与水接触，可在一定程度上增加药物溶出，但效果不如Bai/HA Co 。在不同的pH 环境中，随着pH 升高，复合物、物理混合物、黄芩苷原料药的溶出均增加，这可能是由于黄芩苷属于弱酸性药物[30]，随着pH 升高，解离程度增加，溶解度增大，溶出加快；当pH 达到6.8 时，黄芩苷原料药能较好地溶解，溶出快，因此与复合物、物理混合物的溶出没有显著差异。

药物动力学实验结果显示Bai/HA Co 的血药浓度高于黄芩苷，这是由于在Bai/HA Co 中，黄芩苷以无定型状态存在，溶解度增大；同时，黄芩苷高度分散在亲水性的透明质酸中，增加了药物与胃肠液接触面积，加快了药物的溶出，使吸收增加，从而提高生物利用度。有文献报道，黄芩苷的药动/ 药效模型（PK/PD modelling ）研究显示黄芩苷抗氧化作用的发挥与黄芩苷的浓度呈正相关性[31]，其抗炎效果也由于黄芩苷血药浓度的提高而得到了明显改善[32]，因此Bai/HA Co 对于黄芩苷生物利用度的提高将有助于改善黄芩苷的体内药效。同时，黄芩苷的血药浓度曲线呈现出的非单一吸收峰可能是由于黄芩苷存在肝肠循环，使得吸收入血的黄芩苷通过胆汁排入肠道，在肠道中又被重新吸收所导致。

本实验通过分子对接和分子动力学模拟黄芩苷与不同多糖的相互结合可以较好地预测多糖对难溶性药物的增溶能力，模拟结果与增溶实验结果一致。以透明质酸为载体，采用加热搅拌结合冷冻干燥法成功制备了Bai/HA Co 。该法操作简单可行，制得的复合物质地疏松、水溶性好，可有效提高黄芩苷溶解度、溶出度和生物利用度。同时，透明质酸是一种天然存在于人体组织中的多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，不引起明显毒副作用，Bai/HA Co 具有广阔的应用前景。Bai/HA Co 的MD 模拟揭示了黄芩苷分子与透明质酸分子链形成Bai/ HA Co 的方式，可为后续相关研究提供指导。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）返回搜狐，查看更多